Art. 2

Art. 2

In vigore dal 30 mag 1986
Il presente regolamento entra in vigore il ventunesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri. Fatto a Bruxelles, il 30 maggio 1986. Per la Commissione COCKFIELD Vicepresidente (1) GU n. L 14 del 21. 1. 1969, pag. 1. (2) GU n. L 191 del 19. 7. 1984, pag. 1. (3) GU n. L 141 del 12. 6. 1969, pag. 24. (4) GU n. L 56 dell'1. 3. 1977, pag. 46. (5) GU n. L 323 del 29. 11. 1980, pag. 1. ALLEGATO « ALLEGATO V 1.2 // 1. // Oggetto e campo di applicazione // // Il metodo permette di determinare il tenore in peso di amido o fecola nei concentrati di proteine di soia e nelle merci che ne contengono. // 2. // Definizione // // Si intende come « tenore di amido o fecola » delle merci citate nel punto 1, il valore T come calcolato nel punto 7 del presente metodo. // 3. // Principio // // Il campione si lava con etanolo al 40 % vol per eliminare gli zuccheri e i prodotti di degradazione dell'amido solubili. Il residuo viene disgregato con idrossido di sodio e l'amido viene scisso in unità di glucosio, con amiloglucosidasi. Il dosaggio del glucosio viene effettuato per via enzimatica. // 4. // Reattivi // // (utilizzare acqua bidistillata) // 4.1. // Etanolo al 40 % vol. in acqua // 4.2. // Soluzione di idrossido di sodio 0,5 N (0,5 moli/l) // 4.3. // Acido acetico (glaciale) al 96 % come minimo // 4.4. // Soluzione di amiloglucosidasi: // // immediatamente prima dell'impiego, sciogliere circa 10 mg amiloglucosidasi (EC 3.2.1.3) (6 U/mg) in un ml d'acqua (1). // 4.5. // Tampone trietanolamina: // // sciogliere 14,0 g di cloridrato di trietanolamina [cloruro di tris (2-idrossietil) ammonio] e 0,25 g di solfato di magnesio (MgSO4 ; 7H2O) in 80 ml d'acqua, aggiungervi circa 5 ml di soluzione di idrossido di sodio 5 N (5 moli/l) e aggiustare il pH a 7,6 con una soluzione di idrossido di sodio 1 N (1 mole/l). Portare a 100 ml con acqua. Questo tampone si conserva per almeno 4 settimane a 4 °C. // 4.6. // Soluzione di NADP (Nicotinammine-adenina-dinucleotide fosfato, sale disodico): // // sciogliere 60 mg di NADP in 6 ml di acqua. Questa soluzione si conserva per almeno 4 settimane a 4 °C. // 4.7. // Soluzione di ATP (Adenosina-5'-trifosfato, sale disodico): // // sciogliere 300 mg di ATP.3H2O e 300 mg di idrogenocarbonato di sodio (NaHCO3) in 6 ml di acqua. Questa soluzione si conserva per almeno 4 settimane a 4 °C. // 4.8. // Sospensione di HK/G6P-DH [HK (EC 2.7.1.1 (esochinasi)] e [G6P-DH (glucosio-6-fosfato deidrogenasi)] (EC 1.1.49): // // mettere in sospensione 280 U di HK e 140 U di G6P-DH in 1 ml di soluzione di solfato di ammonio (C= 3,2 moli/l). Tale sospensione si conserva almeno un anno a 4 °C. // 5. // Apparecchiatura // 5.1. // Centrifuga con accelerazione minima di 1 000 × g (calcolata a metà del tubo) // 5.2. // Tubi per centrifuga di vetro da 100 ml // 5.3. // Agitatore magnetico con bagnomaria a 60 °C // 5.4. // Barrette magnetiche // 5.5. // Spettrofotometro UV, munito di una vaschetta di 1 cm // 5.6. // Pipette per // 6. // Procedimento // 6.1. // Lavaggio del campione con etanolo, disgregazione mediante idrossido di sodio e idrolisi enzimatica dell'amido. // 6.1.1. // In base al tenore presunto di amido, scegliere le pesate come appresso indicato (il tenore di amido non deve superare 0,4 g per pesata): 1.2.3.4 // // // // // Tenore in amido presunto del prodotto in g/100 g // Pesata approssimativa (p) (in g) // Volume del pallone tarato in ml // Fattore di diluizione fino al litro (f) // // // // // > 70 // 0,35 - 0,4 // 500 // 2 // 20 - 70 // max. 0,5 // 500 // 2 // 5 - 20 // max. 1 // 250 // 4 // < 5 // max. 2 // 200 // 5 // // // // 1.2 // 6.1.2. // Pesare il campione in un tubo di centrifuga (5.2) con precisione a 0,1 mg e aggiungere 50 ml di etanolo al 40 % vol. (4.1.). // 6.1.3. // Agitare per 20 minuti a temperatura ambiente sull'agitatore magnetico. // 6.1.4. // Lasciare la barretta magnetica nel tubo e centrifugare per 5 minuti. // 6.1.5. // Aspirare con la massima precauzione ed eliminare la fase liquida (pompa ad acqua o pipetta Pasteur). // 6.1.6. // Lavare il residuo, agitando, con 25 ml di etanolo al 40 % vol. (4.1.) almeno due volte ancora. // 6.1.7. // Centrifugare, aspirare con la massima precauzione ed eliminare la fase liquida. // 6.1.8. // Fare queste operazioni (6.1.6. e 6.1.7.) almeno ancora una volta. // 6.1.9. // Aggiungere al residuo 50 ml di soluzione di idrossido di sodio 0,5 N (4.2.) e mantenere la temperatura di 60 °C continuando ad agitare per 30 minuti nel bagnomaria (5.3.) con l'agitatore magnetico. // 6.1.10. // Aggiustare il pH 4,6-4,8 con qualche ml di acido acetico concentrato (4.3.). // 6.1.11. // Collocare il tubo da centrifuga nel bagnomaria con l'agitazione magnetico a 60 °C (5.3), aggiungere 1,0 ml di soluzione dell'enzima (4.4.) e lasciare agire per 30 minuti, sotto agitazione. // 6.1.12. // Dopo raffreddamento trasferire quantitativamente nel pallone tarato (6.1.1.) e portare a segno con acqua. // 6.1.13. // Se necessario, filtrare attraverso un filtro a pieghe. // 6.2. // Dosaggio del glucosio // 6.2.1. // La soluzione da analizzare deve contenere 100-1000 mg di glucosio per litro, a cui corrisponde un DE 340 entro 0,1-1,0. Tale soluzione, diluita in una proporzione di 1 + 30 con acqua non deve presentare a 340 nm un'assorbanza superiore a 0,4 (misurata rispetto all'aria). // 6.2.2. // Portare il tampone (4.5.) a temperatura ambiente (20 °C). // 6.2.3. // La temperatura dei reattivi e del campione deve essere di 20 °C-25 °C. // 6.2.4. // Misurare l'assorbanza a 340 nm rispetto all'aria (senza vaschetta nel cammino ottico di riferimento). // 6.2.5. // Esecuzione secondo lo schema di prelevamento in appresso indicato: 1.2.3 // // // // Introdurre nelle vaschette // Bianco (ml) // Campione (ml) // // // // Tampone (reattivo 4.5) // 1,00 // 1,00 // NADP (reattivo 4.6) // 0,10 // 0,10 // ATP (reattivo 4.7) // 0,10 // 0,10 // Soluzione di saggio (6.1.12 o 13) // - // 0,10 // Acqua bidistillata // 2,00 // 1,90 // // // 1.2 // // Mescolare, dopo circa 3 minuti misurare l'assorbanza delle soluzioni (E1). // // Avviare la reazione aggiungendo: 1.2.3 // // // // HK/G6P.DH (reattivo 4.8) // 0,02 // 0,02 // // // 1.2 // // Mescolare, attendere la fine della reazione (circa 15 minuti) e misurare l'assorbanza delle soluzioni (E2). // // Tener conto di eventuali reazioni di deriva. // // Se la reazione non è terminata dopo 15 minuti, leggere l'assorbanza ad intervalli di 5 minuti fino a che l'aumento di assorbanza non sia costante in 5 minuti. In caso di aumento costante di assorbanza di E2 estrapolare l'assorbanza al momento dell'aggiunta della sospensione 4.8. // // // 6.2.6. // Per il campione di riferimento (bianco) e di quello in analisi (campione), calcolare la differenza di assorbanza E2 E1. Sottrarre la differenza di assorbanza del riferimento (bianco) da quella del campione ( = DE): // // ( DE = DE campione DE bianco) // // Da questa differenza si ottiene il tenore in glucosio della soluzione del campione: // // Contenuto in glucosio in g/l della soluzione del campione 1.2.3.4 // // G = // 3,22 × 180,16 6,3 × 1 × 0,1 × 1 000 // × DE340 = 0,921 × DE340 1.2 // // Il peso molecolare del glucosio è 180,16 (g/moli) // 6.2.7. // Se la misura dell'assorbanza non è possibile a 340 nm, la misura può essere fatta alla lunghezza d'onda di 365 nm o 334 nm. La cifra 6,3 della formula G di cui sopra deve essere sostituita con 3,5 o 6,18 rispettivamente. // 7. // Calcolo e espressione dei risultati // // T = tenore di amido in g/100 g 1.2.3 // // T = // 100 × 0,9 × G p × f 1.2 // // in cui: 1.2.3 // // G // = glucosio in g/l (6.2.6.) // // f // = fattore di diluizione (6.1.1.) // // p // = pesata del campione, in g // // 0,9 // = fattore di conversione del glucosio in amido. ». l'analisi enzimatica (1) Dove U è l'unità internazionale dell'attività enzimatica.
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