Art. 2

In vigore dal 21 ago 1990

Il presente regolamento entra in vigore il giorno della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. Esso si applica a decorrere dal 1o marzo 1991. Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri. Fatto a Bruxelles, il 21 agosto 1990. Per la Commissione Ray MAC SHARRY Membro della Commissione (1) GU n. L 148 del 28. 6. 1968, pag. 13. (2) GU n. L 378 del 27. 12. 1989, pag. 1. (3) GU n. L 199 del 7. 8. 1979, pag. 1. (4) GU n. L 296 del 29. 10. 1988, pag. 50. (5) GU n. L 169 del 18. 7. 1968, pag. 4. (6) GU n. L 118 del 29. 4. 1989, pag. 7. ALLEGATO « ALLEGATO IV DETERMINAZIONE DEL LATTOSIERO PRESAMICO IN POLVERE NEL LATTE SCREMATO IN POLVERE E NELLE MISCELE DI CUI AL REGOLAMENTO (CEE) N. 1725/79 1.2 // 1. // Obiettivo: ricerca dell'aggiunta di lattosiero presamico in polvere: // // a) al latte scremato in polvere come definito all' del regolamento (CEE) n. 986/68 e // // b) alle miscele di cui all', paragrafo 3 del regolamento (CEE) n. 1725/79. // 2. // Riferimenti: norma internazionale ISO 707 // // Latte e prodotti lattieri: - metodi di campionamento, conformemente agli orientamenti che figurano nell'allegato I, punto 2, lettera c) del regolamento (CEE) n. 625/78. // 3. // Definizione // // Il contenuto di lattosiero presamico in polvere è espresso come percentuale di massa determinato secondo il metodo in appresso descritto. // 4. // Principio // // Determinazione della quantità di glicomacropeptide A conformemente al regolamento (CEE) n. 625/78, allegato V. I campioni che danno risultati positivi sono analizzati ai fini della ricerca del glicomacropeptide A mediante il metodo per cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in fase inversa. Valutazione del risultato ottenuto in confronto con campioni di riferimento costituiti da latte scremato in polvere esente o addizionato di una percentuale nota di lattosiero in polvere. I risultati superiori all'1 % (p/p) mostrano la presenza di polvere di lattosiero presamico. // 5. // Reattivi // // Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica riconosciuta. L'acqua da impiegare deve essere acqua distillata o acqua di purezza almeno equivalente. L'acetonitrile dovrebbe essere di qualità spettroscopica o HPLC. // // I reattivi necessari per il metodo descritto nel regolamento (CEE) n. 625/78 sono descritti nell'allegato V di tale regolamento. // // Reattivi per HPLC in fase inversa. // 5.1. // Soluzione di acido tricoloracetico // // Sciogliere in acqua 240 g di acido tricloroacetico (CCI3COOH) e portare a 1 000 ml. // 5.2. // Eluente A e B // // Eluente A: 150 ml di acetonitrile (CH3CN), 20 ml di isopropanolo (CH3CHOHCH3) e 1,00 ml di acido trifluoroacetico (TFA, CF3COOH) sono portati a 1 000 ml con acqua. Eluente B: 550 ml di acetonitrile, 20 ml di isopropanolo e 1,00 ml di TFA sono portati a 1 000 ml con acqua. Filtrare la soluzione eluente prima dell'impiego, su membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 mm. // 5.3. // Conservazione della colonna // // Dopo le analisi la colonna viene lavata con l'eluente B (con gradiente) e successivamente con acetonitrile (con gradiente in 30 minuti). La colonna viene conservata in acetonitrile. // 5.4. // Campioni di riferimento // 5.4.1. // Latte scremato in polvere rispondente ai requisiti del regolamento (CEE) n. 625/78, indicato in appresso con [0]. // 5.4.2. // Lo stesso latte, sofisticato al 5 % (p/p) con lattosiero in polvere di tipo presamico di composizione media, indicato in appresso con [5]. // 5.4.3. // Lo stesso latte sofisticato al 50 % (p/p) con lattosiero in polvere di tipo presamico di composizione media, indicato in appresso con [50] (*) // 6. // Apparecchiatura // // L'apparecchiatura necessaria per il metodo descritto nel regolamento (CEE) n. 625/78 è descritta nell'allegato V di detto regolamento. // // Apparecchiatura diano risultati equivalenti alle polveri NIZO. // 6.1. // Bilancia analitica // 6.2. // Centrifuga capace di raggiungere 2 200 giri e fornita di provette a tappo della capacità di 50 ml circa // 6.3. // Agitatore meccanico in grado di funzionare a 50 °C // 6.4. // Agitatore magnetico // 6.5. // Imbuti in vetro del diametro di 7 cm circa // 6.6. // Dischi di carta da filtro (porosità media) del diametro di 12,5 cm circa // 6.7. // Dispositivo di filtrazione in vetro provvisto di membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 mm // 6.8. // Pipette graduate capaci di erogare 10 ml (norma ISO 648, classe A o ISO/R 835) oppure un sistema capace di erogare 10,0 ml in due minuti. // 6.9. // Bagnomaria, termostatato a 25 ± 0,5 °C. // 6.10. // Apparecchiatura HPLC comprendente: // 6.10.1. // Sistema di pompaggio a gradiente binario // 6.10.2. // Iniettore manuale o automatico da 100 mm di capacità // 6.10.3. // Colonna Dupont Protein Plus (25 × 0,46 cm I. D.) o una colonna equivalente per fase inversa a base di silice a pori larghi // 6.10.4. // Forno a colonna, termostatato a 35 ± 1 °C // 6.10.5. // Rilevatore UV a lunghezza d'onda variabile, capace di effettuare misure fino a 210 nm (se necessario si può utilizzare una lunghezza d'onda superiore, fino a 220 nm), con la sensibilità di 0,02 AA // 6.10.6. // Integratore capace di misurare l'altezza dei picchi // // NOTA // // È possibile far funzionare la colonna a temperatura ambiente, purché tale temperatura non abbia fluttuazioni superiori ad 1 °C, altrimenti il tempo di ritenzione del GMPA sarebbe soggetto a variazioni troppo grandi. // 7. // Campionamento // 7.1. // Norma internazionale ISO 707 - latte e prodotti lattieri - metodi di campionamento, conformemente agli orientamenti contenuti nell'allegato I, punto 2, lettera c) del regolamento (CEE) n. 625/78. // 7.2. // Conservare il campione in condizioni tali da non consentire alcuna deteriorazione o modifica di composizione. // 8. // Modo di operare // 8.1. // Preparazione del campione per la prova // // Travasare la polvere in un recipiente di capacità all'incirca doppia del volume della polvere, provvisto di un coperchio impermeabile all'aria. Chiudere immediatamente il recipiente. Mescolare bene il latte in polvere capovolgendo più volte il recipiente. // 8.2. // Aliquota da analizzare // // In una provetta da centrifuga (6.2) o in una bottiglia chiusa idonea (50 ml) pesare 2,000 g del campione con l'approssimazione di 0,001 g. // 8.3. // Eliminazione dei grassi e delle proteine // 8.3.1. // Aggiungere all'aliquota da analizzare 20,0 g di acqua calda (50 °C). Sciogliere la polvere agitando per 5 minuti, o per 30 minuti nel caso di latticello acido, con l'agitatore meccanico (6.3). Mettere la provetta a bagnomaria (6.9) finché raggiunge i 25 °C. // 8.3.2. // Aggiungere 10,0 ml di soluzione di acido tricloroacetico a 25 °C (5.1) senza interruzione per 2 minuti, agitando vigorosamente con l'agitatore magnetico (6.4). Mettere la provetta nel bagnomaria (6.9) e mantenervela per 60 minuti. // 8.3.3. // Centrifugare (6.2) a 2 200 giri per 10 minuti oppure filtrare su carta (6.6), eliminando i primi 5 ml di filtrato. // 8.4. // Determinazione cromatografica // 8.4.1. // Eseguire l'analisi HPLC come descritto nel regolamento (CEE) n. 625/78, allegato V. Se si ottiene un risultato negativo il campione analizzato non contiene polvere di lattosiero presamico in quantità rilevabili. In caso di risultato positivo si deve applicare il metodo HPLC in fase inversa descritto in appresso. La presenza di polvere di latticello acido può dare origine a risultati falsamente positivi. Il metodo HPLC in fase inversa esclude questa possibilità. // 8.4.2. // Prima di eseguire l'analisi HPLC in fase inversa andranno ottimizzate le condizioni del gradiente. Un tempo di ritenzione di 26 minuti ± 2 minuti per il GMPA è ottimale per i sistemi a gradiente con un volume morto di circa 6 ml (volume dal punto in cui i solventi confluiscono sino al volume del circuito dell'iniettore, compreso). Per i sistemi a gradiente con un volume morto inferiore (ad esempio 2 ml) si deve utilizzare come tempo ottimale di ritenzione un tempo di 22 minuti. // // Prendere soluzioni dei campioni di riferimento (5.4) con e senza lattosiero presamico al 50 %. // // Iniettare 100 ml del surnatante o del filtrato (8.3.3) nell'apparecchiatura HPLC operante alle condizioni di gradiente di esplorazione date nella tabella 1. // // Tabella 1. Condizioni del gradiente di esplorazione per l'ottimizzazione della cromatografia 1.2.3.4.5 // // // // // // Tempo (minuti) // Flusso (ml/minuto) // % A // % B // Curva // // // // // // Iniziale // 1,0 // 90 // 10 // * // 27 // 1,0 // 60 // 40 // lin // 32 // 1,0 // 10 // 90 // lin // 37 // 1,0 // 10 // 90 // lin // 42 // 1,0 // 90 // 10 // lin // // // // // 1.2 // // Confrontando i due cromatogrammi si dovrebbe individuare il picco del GMPA. // // Utilizzando la formula che segue si può calcolare la composizione del solvente iniziale da utilizzare per il gradiente normale (secondo 8.4.3): // // % B = 10 - 2,5 + [13,5 + (RTgmpA - 26)/6] *30/27 // // % B = 7,5 + [13,5 + (RTgmpA - 26)/6] *1.11 // // In cui: 1.2.3 // // RTgmpA: // tempo di ritenzione del GMPA nel gradiente di esplorazione. // // 10: // la % B iniziale del gradiente di esplorazione. // // 2,5: // la % B al punto intermedio meno la % B al punto iniziale nel gradiente normale. // // 13,5: // tempo del punto intermedio del gradiente di esplorazione. // // 26: // tempo di ritenzione necessario del GMPA. // // 6: // rapporto dei coefficienti di direzione del gradiente di esplorazione e del gradiente normale. // // 30: // la % B al punto iniziale meno la % B a 27 minuti nel gradiente di esplorazione. // // 27: // tempo di operazione del gradiente di esplorazione. 1.2 // 8.4.3. // Prendere soluzioni dei campioni per la prova // // Iniettare nell'apparecchio HPLC 100 ml del surnatante o del filtrato (8.3.3) misurati esattamente, mantenendo la veolocità di flusso della soluzione eluente (5.2) sul valore di 1,0 ml/minuto. // // La composizione dell'eluente all'inizio dell'analisi si ottiene da 8.4.2. Normalmente essa è prossima ad A : B = 76 : 24 (5.2). Subito dopo l'iniezione viene avviato un gradiente lineare che dopo 27 minuti porta ad una percentuale di B maggiore del 5 %. Successivamente viene avviato un gradiente lineare che in 5 minuti porta la composizione dell'eluente a 90 % B. Questa composizione viene mantenuta per 5 minuti, dopo di che con un gradiente lineare la composizione cambia e torna in 5 minuti a quella iniziale. Sulla base del volume interno del sistema di pompaggio l'iniezione successiva può essere effettuta 15 minuti dopo aver raggiunto le condizioni iniziali. // // Osservazioni // // 1. Il tempo di ritenzione del glicomacropeptide deve essere di 26 minuti ± 2 minuti. Esso può essere ottenuto variando le condizioni iniziali e finali del primo gradiente. Tuttavia la differenza nella % B per quanto riguarda le condizioni iniziali e finali del primo gradiente deve rimanere del 5 % B. // // 2. Gli eluenti devono essere adeguatamente degassati e restalio. Ciò è essenziale per il corretto funzionamento del sistema di pompaggio del gradiente. La deviazione standard per il tempo di ritenzione del picco GMP deve essere inferiore a 0,1 minuto (n=10). // // 3. Ogni 5 campioni è necessario iniettare il campione di riferimento [5] da utilizzare per calcolare un nuovo fattore di risposta R (9.1.1). // 8.4.4. // I risultati dell'analisi cromatografica del campione per la prova [E] sono ottenuti sotto forma di un cromatogramma in cui il picco GMP è identificato dal suo tempo di ritenzione che è di circa 26 minuti. // // L'integratore (6.10.6) calcola automaticamente l'altezza di picco H del picco GMP. In ogni cromatogramma si deve controllare la posizione della linea di base. Se la linea di base non è stata correttamente localizzata occorre ripetere l'analisi o l'integrazione. // // Prima di procedere all'interpretazione quantitativa è necessario esaminare l'aspetto di ciascun cromatogramma al fine di individuare anomalie dovute al cattivo funzionamento dell'apparecchio o della colonna, oppure all'origine e alla natura del campione analizzato. In caso di dubbio, ripetere l'analisi. // 8.5. // Taratura // 8.5.1. // Applicare esattamente ai campioni di riferimento (5.4.1-5.4.2) il modo di operare descritto dal punto 8.2 al punto 8.4.4. Utilizzare soluzioni preparate di recente, in quanto a temperatura ambiente in ambiente tricloroacetico all'8 % il GMP si degrada. A 4 °C la soluzione rimane stabile per 24 ore. Nel caso si debba procedere a lunghe serie di analisi è opportuno l'impiego nell'iniettore automatico di una vaschetta raffreddata per il campione. // // NOTA // // 8.4.2 può essere omesso se la % B alle condizioni iniziali è nota da analisi precedenti. // // Il cromatogramma del campione di riferimento [5] dovrebbe essere analogo alla figura 1. In questa figura il picco GMPA è preceduto da due piccoli picchi. È essenziale ottenere una separazione analoga. // 8.5.2. // Prima di procedere alla determinazione cromatografica dei campioni iniettare 100 ml del campione di riferimento senza lattosiero presamico [0] (5.4.1). Nel cromatogramma non si deve vedere un picco al tempo di ritenzione del picco GMPA. // 8.5.3. // Determinare i coefficienti di risposta R iniettando un volume di filtrato (8.5.1) pari a quello utilizzato per i campioni. // 9. // Espressione dei risultati // 9.1. // Metodo di calcolo e formule // 9.1.1. // Calcolo del coefficiente di risposta R: // // Picco GMP : R = W/H // // In cui: 1.2.3 // // R // = coefficiente di risposta del picco GMP // // H // = altezza del picco GMP // // W // = quantità di lattosiero presente nel campione di riferimento [5]. 1.2 // 9.2. // Calcolo della percentuale di lattosiero presamico in polvere contenuto nel campione: // // W[E] = R × H[E] // // In cui: 1.2.3 // // W[E] // = percentuale (m/m) di lattosiero presamico contenuto nel campione [E] // // R // = coefficiente di risposta del picco GMP (9.1.1). // // H[E] // = altezza del picco GMP del campione [E]. 1.2 // // Se W[E] è maggiore dell'1 % e la differenza fra il tempo di ritenzione del campione di riferimento [5] è inferiore a 0,2 minuti, è presente lattosiero presamico in polvere. // 9.3. // Precisione del metodo // 9.3.1. // Ripetibilità // // La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate simultaneamente o a breve distanza di tempo dallo stesso analista, impiegando la stessa apparecchiatura e sulla stessa aliquota di campione non deve superare lo 0,2 % p/p. // 9.3.2. // Riproducibilità // // Non ancora determinata. // 9.3.3. // Linearità // // Dallo 0 al 16 % di lattosiero presamico si deve ottenere una relazione lineare con un coefficiente di correlazione > 0,99. // 9.4. // Interpretazione // 9.4.1. // Si considera che ci sia presenza di siero se il risultato ottenuto al punto 9.2 è superiore ad 1 % p/p e il tempo di ritenzione del picco GMP differisce di meno di 0,2 minuti da quello del campione di riferimento [5]. Il limite dell'1 % è fissato conformemente alle disposizioni del regolamento (CEE) n. 625/78, allegato V, punti 9.2 e 9.4.1. Assorbanza (220 nm) » per HPCL in fase inversa: (*) Il lattosiero in polvere di tipo presamico di composizione media nonché il latte in polvere sofisticato si possono ottenere dalla NIZO, Kernhemseweg 2, Postbus 20, NL-6710 BA, Ede. Si possono comunque impiegare polveri che

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