Art. 7
In vigore dal 14 giu 1988
Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.
Fatto a Lussemburgo, addì 14 giugno 1988.
Per il Consiglio Il Presidente I. KIECHLE
(1) GU n. C 5 del 9. 1. 1988, pag. 5. (2) GU n. C 49 del 22. 2. 1988, pag. 164. (3) GU n. C 80 del 28. 3. 1988, pag. 34. (4) GU n. L 145 del 13. 6. 1977, pag. 44. (5) GU n. L 15 del 19. 1. 1978, pag. 34. (6) GU n. L 24 del 27. 1. 1987, pag. 51.(7) GU n. 121 del 29. 7. 1964, pag. 1977/64. (8) GU n. L 357 del 19. 12. 1987, pag. 1.(9) GU n. L 325 dell'1. 12. 1980, pag. 18.
ALLEGATO "ALLEGATO G ESAMI PER LA RICERCA DELLA LEUCOSI BOVINA ENZOOTICA La ricerca della leucosi bovina enzootica è effettuata mediante un esame di immunodiffusione come descritto nelle lettere A e B o mediante un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) come descritto nella lettera C. L'esame di immunodiffusione è effettuato solo in esami individuali.
In caso di contestazione debitamente motivata dei risultati degli esami, si effettua un controllo complementare mediante un esame di immunodiffusione.
A. Reazione di immunodiffusione su gel di agar 1. L'antigene da impiegare nella prova deve contenere glicoproteine del virus della leucosi bovina. Esso va standardizzato rispetto a un siero di riferimento (siero E 1) fornito dal laboratorio sierologico veterinario statale danese di Copenaghen.
2. La responsabilità della standardizzazione degli antigeni di laboratorio rispetto al siero ufficiale CEE di riferimento (siero E 1) fornito dal laboratorio sierologico veterinario di Stato di Copenaghen è affidata ai seguenti istituti:
a) Germania Bundesforschungsanstalt fuer Viruskrankheiten der Tiere-Tuebingen;
b) Belgio Institut national de recherches vétérinaires, Bruxelles c) Francia Laboratoire national de pathologie bovine, Lyon d) Granducato del Lussemburgo - e) Italia Istituto zooprofilattico sperimentale, Perugia f) Paesi Bassi Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling Rotterdam g) Danimarca Statens Veterinaere Serumlaboratorium, Koebenhavn h) Irlanda Veterinary Research Laboratory, Abbotstown, Dublin i) Regno Unito 1. Gran Bretagna The Central Veterinary Laboratory, Weybridge, England,
2. Irlanda del Nord The Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast j) Spagna Laboratorio de Sanidad y Producción Animal de Barcelona k) Portogallo Laboratório Nácional de Investigaçao Veterinária, Lisboa.
3. Gli antigeni standard di laboratorio devono essere presentati almeno una volta all'anno ai laboratori di riferimento CEE elencati al paragrafo 2 per essere esaminati in rapporto al siero CEE. Indipendentemente da detta standardizzazione, l'antigene in uso può essere standardizzato secondo la tecnica descritta alla lettera B.
4. I reattivi da impiegare sono i seguenti:
a) antigene: esso dovrà contenere le glicoproteine specifiche del virus della leucosi bovina enzootica standardizzato rispetto al siero ufficiale CEE;
b) siero in esame;
c) siero di controllo riconosciuto positivo;
d) gel di agar 0,8 % di agar 8,5 % di NaCl tampone Tris 0,05 M a pH 7,2;
versare 15 ml di questo terreno in una scatola Petri del diametro di 85 mm, in modo da ottenere uno strato dello spessore di 2,6 mm.
5. Nell'agar sul fondo della scatola ricavare sette pozzetti, esenti da umidità e distribuiti come segue: un pozzetto centrale e 6 pozzetti disposti in cerchio attorno ad esso;
diametro del pozzetto centrale : 4 mm,
diametro dei pozzetti periferici: 6 mm,
distanza fra il pozzetto centrale e i pozzetti periferici: 3 mm.
6. Riempire il pozzetto centrale con l'antigene standard, i pozzetti periferici 1 e 4 (vedi lo schema) con un siero riconosciuto come positivo e i pozzetti 2, 3, 5 e 6 con i sieri in esame. Il riempimento va effettuato fino a scomparsa del menisco.
A. 6.
1 k 6 kk 2 k 5 kk 3 k 4 7. Le quantità di reattivi da impiegare sono dunque le seguenti:
antigene:
32 microlitri,
siero di controllo:
73 microlitri.
sieri in esame:
73 microlitri.
8. Incubare per 72 ore a temperatura ambiente (20-27 °C), in atmosfera confinata ed umida.
9. La lettura può essere effettuata dopo 24 e 48 ore, ma non è possibile ottenere il risultato finale prima di 72 ore.
a) Il siero in esame è positivo se forma una linea specifica di precipitine con l'antigene del virus della LBE e una linea completa di identità con il siero di riferimento;
b) il siero in esame è negativo se non forma una linea specifica di precipitazione con l'antigene della LBE e se non provoca l'incurvamento della linea del siero di riferimento;
c) la reazione è considerata non conclusiva:
ii) se la linea del siero di riferimento si incurva verso l'antigene della LBE senza formare con l'antigene una linea di precipitine visibile, ovvero ii) se non può essere interpretata come negativa o positiva.
Quando la reazione non è conclusiva, la prova può essere ripetuta e può essere impiegato siero concentrato.
B.
Metodo per la standardizzazione dell'antigene Soluzioni e materiali necessari:
1. 40 ml di agarosio all'1,6 % in tampone Tris/HCl 0,05 a pH 7,2, contenente l'8,5 % di NaCl;
2. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:10 in tampone Tris/HCl 0,05 M a pH 7,2, contenente l'8,5 % di NaCl;
3. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:5 in tampone Tris/HCl 0,05 a pH 7,2, contenente l'8,5 di NaCl;
4. 4 scatole Petri in plastica, del diametro di 85 mm;
5. un punzone del diametro di 4-6 mm;
6. antigene di riferimento;
7. antigene da standardizzare;
8. bagnomaria (56 °C).
Modo di operare:
Sciogliere l'agarosio (1,6 %) nel tempone Tris/HCl, riscaldando cautamente a 100 °C. Mettere in bagnomaria a 56 °C per circa 1 ora. Porre in bagnomaria a 56 °C anche le diluizioni di siero della leucosi bovina.
Mescolare 15 ml della soluzione di agarosio a 56 °C con 15 ml di siero della leucosi bovina (1:10), agitare rapidamente e versare due porzioni da 15 ml della miscela in due scatole Petri. Ripetere il procedimento con il siero della leucosi bovina diluito 1:5.
Quando l'agarosio si è solidificato, praticare i pozzetti secondo il seguente schema:
Aggiunta di antigene II. Scatole Petri 1 e 3:
pozzetto A - antigene di riferimento non diluito,
pozzetto B - antigene di riferimento, diluito 1:2,
pozzetti C + E - antigene di riferimento,
pozzetto D - antigene da controllare, non diluito.
II. Scatole Petri 2 e 4:
pozzetto A - antigene in esame, non diluito,
pozzetto B - antigene in esame, diluito 1:2,
pozzetto C - antigene in esame, diluito 1:4,
pozzetto D - antigene in esame, diluito 1:8.
Istruzioni complementari 1. Per realizzare una precipitazione ottimale, l'esperimento va effettuato con due diluizioni di siero (1:5 e 1:10).
2. Se il diametro di precipitazione è troppo piccolo ad ambedue le diluizioni, il siero va ulteriormente diluito.
3. Se la precipitazione per ambedue le diluizioni è indistinta e il diametro è troppo grande, per il siero va scelta una diluizione inferiore.
4. La concentrazione finale dell'agarosio deve essere dello 0,8 %; quella dei sieri deve essere rispettivamente del 5 % e del 10 %.
5. Riportare i diametri misurati sull'accluso sistema di assi coordinati. La diluizione di lavoro deve corrispondere alla diluizione dell'antigene sotto prova che ha lo stesso diametro dell'antigene di riferimento.
"C. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la ricerca della leucosi bovina enzootica 1. Per procedere al saggio ELISA occorrono le attrezzature e i reattivi qui indicati:
a) micropiastre, cuvette o qualsiasi altro recipiente per la fase solida;
b) l'antigene è fissato sulla fase solida con o senza l'ausilio di anticorpi leganti policlonali o monoclonali. Se la fase solida è rivestita direttamente dall'antigene, tutti i campioni in esame che presentano reazione positiva devono essere riesaminati facendo riferimento all'antigene di controllo. Quest'ultimo deve essere identico all'antigene in questione, salvo nel caso di antigeni della leucosi bovina enzootica. Se gli anticorpi leganti sono distribuiti sulla fase solida, gli anticorpi non devono reagire ad antigeni diversi da quelli della leucosi bovina enzootica;
c) il fluido biologico (siero o latte) da esaminare;
d) un controllo positivo o negativo;
e) il coniugato: una qualunque immunoglobulina antibovina biotinilata o coniugata con un enzima oppure una immunoglobulina anti-BLV biotinilata o coniugata con un enzima;
f) l'avidina: enzima per le prove, qualora si utilizzino preparati di immunoglobulina biotinilata;
g) un substrato adatto all'enzima impiegato;
h) una soluzione di arresto;
i) soluzioni tamponate per la diluizione dei campioni per la praparazione dei reattivi e per il lavaggio;
j) un sistema di lettura con filtri appropriati corrispondenti al substrato impiegato.
2. Standardizzazione e sensibilità della prova La sensibilità del saggio ELISA deve essere di livello tale che il siero E4 risulti positivo quando è diluito 10 volte (campioni di siero) o 250 volte (campioni di latte) più della diluizione ottenuta da singoli campioni presi congiuntamente.
Nelle prove in cui i campioni (siero e latte) sono esaminati individualmente, il siero E4 diluito nella proporzione di 1:10 (nel siero negativo) o di 1:250 (nel latte negativo) deve presentare una reazione positiva quando è esaminato in una diluizione di prova uguale a quella impiegata per le prove individuali.
Il siero E4 è fornito dal laboratorio veterinario nazionale di Copenaghen.
3. Condizioni di utilizzazione del saggio ELISA Il metodo ELISA può essere utilizzato su un campione di latte prelevato dal latte proveniente da un'azienda in cui almeno il 30 % delle vacche da latte sono in lattazione a condizione che il campione si riferisca al latte prodotto da meno di 50 vacche ed ad una concentrazione di siero di latte ricavato dal latte proveniente da un numero di vacche compreso tra un minimo di 20 ed un massimo di 50, e che, qualora il latte raccolto provenga da più di 50 vacche, il numero di prelievi sia aumentato proporzionalmente.
Il metodo ELISA può essere altresì utilizzato su un campione di sangue prelevato da non più di 50 animali.
Se si ricorre ad una delle facoltà precitate, si devono prendere misure per garantire la corrispondenza tra i campioni prelevati e gli animali da cui provengono il latte esaminato o i sieri.
In caso di risultato positivo su uno dei campioni, il bestiame deve restare sotto controllo ufficiale fin quando non sia stato registrato un risultato negativo per almeno due esami individuali effettuati, ad un intervallo minimo di quattro mesi, su tutti i bovini di età superiore ai sei mesi, conformemente alle succitate disposizioni, e in un laboratorio direttamente ispezionato da un laboratorio menzionato al punto A."
Storico versioni
Questo articolo non ha mai subito modificazioni dalla sua pubblicazione.
Le tue annotazioni
Proeli:dir:1988:406:oj#art-7